Me gusto la experiencia de la actividad. Las facilidades me encantaron y me quede con las ganas de un “tours” por el laboratorio.  En el panel pensaba que iban a hablar de algunas oportunidades en la industria y posiciones, pero hablaban mas de lo que hacian y creo que en una de las actividades anteriores ya habian hablado del tema.  Me gusto el que los estudiantes y profesores compartieran sus experiencias, ya que es una realidad que el programa ayuda a los participantes mucho.  La secciones de los poster fue un poco incomoda.  El lugar tenia demasiadas personas y era dificil caminar, escuchar y hablar con las demas personas.  Los estudiantes con los cuales tuve la oportunidad de escuchar en la presentaciones dominaban el tema excelentemente y conocian todo lo relacionado con su investigación y lograron contestar todas mis dudas.  Eso se lo aplaudo al programa por ayudarnos a convertirnos en personas mas compententes en el campo de la ciencia.

La estudiante Rosivette Sntiago Gonzales, trabajo en el proyecto titulado “Generation of Small Insert Metagenomic Libraries From o Tropical Hypersaline Microbial Mats at the Cobo Rojo Saterns in Puerto Rico”.  La metagenomica envuelve el analisis genomico de un ecosistema utilizando un acercamiento de cultivos independientes.  De estamanera estan analisando distintas capas de microbios hipersalinos en Cabo Rojo.  Actualmente se encuentran en el proceso de transformar el DNA clonado en     E. coli.

El estudiante Victor Ocasio Ramirez realiao una investigacion titulada “Quantification NHL gene exprecion using qPCR as a mode for evaluating cyanogenic glucoside breakdown in cassava”.  El qPCR trata de cuantificar cuanto DNA es expresado de algun gen cuantificando las cantidades de RNA que ese gen a producido.  Se estaba tratando de medir donde el cianuro estaba siendo expresado en la planta de cassava.  No se pudo encontrar alguna correlacion entre la expresion del cianuro y alguna parte de la planta en especifico.

El estudiante A. Lopez Cruz trabajo en el proacto “Preparation of magnetic nanoparticles with covalently bound chitosan and chitosan oligosaccharide lactate”. El chitosan es un polisacarido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina (undad acetilatada). Esta substancia tiene una gran cantidad de aplicaciones comerciales y biomédicas.  Los resultados de infrarojo demostraron intercambio de ligandos y formacion de enlaces de amida.

En mi investigación durante este semestre he afrontado varios problemas por eso le doy un 2. Entre esos problemas está el que empezamos tarde el semestre y ya pronto es el día de presentar los afiches. Esto crea problemas porque tenemos que hacer dos cosas a la misma vez y se dificultad volver a repetir los experimentos porque tenemos una agenda con experimetos bastante cargada. Para resolver esto hemos planeado los experimentos muy bien y de todos modos hay factores que son dificiles de controlar por lo hay casos en los que si tenemos que repitir y se atrasan los demas experimentos. Otro factor es muchas veces hay mucho conflicto con las clases y los profesores, porque deciden dar reposiciones de clases a las que faltan en horas que usualmente se utilizan para hacer experimentos.

Screening and Analyses of Error Prone PCR Generated
Green Fluorescent Protein (GFP) Variants
Introduction: Biological engineering is a form of synthetic life, since specific DNA components are introduced into an organism’s genome.  The modified organism will respond as it is programmed.  The Green Fluorescent Protein (GFP) produces light by fluorescence that is emitted from its fluorophore center composed of the Ser-65, Tyr-66, and Gly-67 amino acid sequence.  Methods: The pGLO plasmid containing GFP was purified using the Alkaline Lysis Plasmid Purification method, the GFP gene was verified by restriction digestion of pGLO plasmid using the restriction endonucleases BamHI and HindIII, and the digested plasmid visualized using agarose gel electrophoresis.  We used Bioinformatics techniques and sequence databases to design primer sequences, using the Primer3 Internet program, that were used to amplify the GFP gene from the pGLO plasmid using the polymerase chain reaction (PCR).  We performed PCR under normal conditions (N) and multiple cycles of Error Prone PCR to create GFP mutagenized variants.  In the Error Prone PCR, the PCR conditions are altered in order to cause random errors when the Taq polymerase replicates the template strand.  The first cycle of mutagenic PCR (M1) was amplified directly from the pGLO plasmid template.  In the second cycle of mutagenic PCR (M2), the product from the first mutagenic cycle was mutated again under error prone conditions.  Then the amplified PCR fragments were purified and the results analyzed using agarose gel electrophoresis. We then ligated the purified PCR fragments to the cloning vectors pGEM-T Easy (Promega) and pET-Blue1 (Novagen).  The vectors ligated to GFP were transformed into E. coli JM109 competent cells to screen for fluorescent colonies that contained the insert (white colonies).  We purified plasmid DNA from GFP clones, used enzymatic digestions to verify the cloning, and the DNA sequence of selected clones were determined.  Results: The pGLO plasmid DNA was purified and three DNA fragments were obtained after restriction digestion with the enzyme BamHI, and two with HindIII confirming its identity as the pGLO plasmid.  Specific GFP upstream and downstream primers were designed based on the downloaded pGLO gene sequence encoding the GFP protein.  PCR reactions using various sets of designed primers amplified GFP fragments of the expected size.  These PCR amplified GFP DNA fragments were successfully cloned into pGEM-T Easy and pET-Blue1 vectors for analysis as shown by agarose gel electrophoresis of mini prep plasmid DNA.  DNA sequence analysis of one of four fluorescent GFP pGEM-T Easy clones revealed a double mutation resulting in two amino acid substitutions (Asn171Asp, Tyr238Asn) whose fluorescent properties are currently being determined.  Conclusions: A rapid screening of randomly generated mutant fluorescent GFP proteins using the pET-Blue1 vector is currently being developed.  In the future, the variant GFP DNA will be inserted in Halobacterium using the shuttle vector pNG168 in order to characterize the properties of the mutated GFP proteins in extremophiles.  We thank the UPR-Cayey Biology Department, RISE Program (NIH GM 59429), and the BioMinds Program (funded by the Amgen Foundation) for supporting this research.

Durante este semestre estaremos 1) transformando clones de GFP pETBlue-1 en células que expresan la polimerasa T7 para identificar los fenotipos mutantes.  Ya que la técnica del semestre pasado fue para confirmar si las células tenían insertos y luego de seleccionar estas células, se extrae el plasmidio y se ponen estas nuevas células que nos permiten ver el fenotipo.  2) Secuenciaremos los clones de GFP mutagénicos y normales.  Esto se hará para identificar los lugares en el genoma que cambiaron y los lugares conservados para la expresión del genotipo.  3) Analizaremos las proteínas mutagénicas de GFP mediante cristalografía para estudiar más a fondo la estructura y cómo fue afectada al compararla con la estructura original de la proteína.  4)  Insertar los genes normales y mutagénicos de GFP en Halobacterium utilizando el pNG168 “Shuttle Vector”.  Estas son nuestras metas y propósitos de todo el proyecto y esperamos poder completarlo a lo largo de este semestre.

El trabajo de este semestre es uno de continuación.  Esta sería la parte final de la investigación de encontrar una variante de GFP con propiedades nuevas y útiles para estudiar la expresión genética en organismos como las archeas, que son bacterias que viven en ambientes extremos.

Las nuevas técnicas que planificamos utilizar son la de cristalografia, la cual se utiliza para estudiar la estructura tridimensional de las proteínas, y además poder estudiar las propiedades físicas de la misma.  También, utilizar un “shuttle vector” para transformar a Halobacterium. El “shuttle vector” es un vector que puede ser insertado en dos organismos.   Esta técnica se usa para expresar un gen en E. coli y luego pasarlo a organismos más complicados como es el caso de Halobacterium.

Este semestre ha sido uno dificil por los eventos que ocurrieron tanto en el pais como en la universidad. Pero logramos varias cosas durante el semestre. Entre ellas diseñamos un nuevo “primer up” para realizar PCR con el gen de la proteina GFP. Las rondas de PCR fueron 3. La primera era en condiciones normales de PCR, la segunda era en condicion mutagenica y la tercera tomamos producto de la primera ronda mutagenica y la volvimos a mutar. Luego ligamos los fragmentos al vector pET-BLUE1. Despues de ligar el fragmento al vector hicimos una transformacion en E. coli. Y para confirmar que nuestro fragemento estaba presente en las colonias que seleccionamos realizamos una digestion enzimatica. Lamentablemente todavia quedan bastantes cosas que hacer antes que finalice el semestre por lo que no puedo decirle algun otro resultado. Pero en lo planes futuros que tenemos es el de estudiar las propiedades nuevas de la proteina GFP mutada. Y por ultimo que es el proposito de este experimento es insertar la proteina en Halobacterium para estudiar la expresion de genes en las archeas.

Al progreso de mi proyecto le doy un 4. Aunque hemos tenidos muchos contratiempos por las condiciones del tiempo, ya mutamos la proteína fluorescente verde con el “primer up” lo único que nos resta es insertarlo en un vector y transformar en E. coli. La contribución de mi proyecto es crear nuevas variantes de la proteína fluorescente verde (GFP), las cuales pueden ser utilizadas como marcadores para estudiar la expresión de genes en ambientes extremos debidos a sus propiedades únicas.

Hasta ahora he aprendido muchísimas técnicas de laboratorio, pero la mas importante durante este semestre para cumplir mis metas va a ser una reacción de PCR (Polymerase Chain Reaction) con “primers” nuevos. Esta reacción tiene como propósito amplificar una región de un plásmido que contiene el gen que codifica para GFP (Green Flourscent Protein) la cual ya hemos mutado en experimentos pasados. Pero esta vez la queremos amplificar desde el codón de iniciación así de esta manera podremos insertarla en un plásmido nuevo que vamos a utilizar que se llama pET-Blue1. Le doy un “3″ e estos momentos al progreso de mi investigación. Ya que he encontrado varios contratiempos, pero que se han podido lidiar con mucha comunicación entre el mentor y los demás estudiantes trabajando en el laboratorio.

Durante el verano tuve la oportunidad de viajar a Los Angeles, California donde realice una investigación en UCLA. Trabajé en el departamento de genética humana y la P.I. es la Dra. Katrina Dipple. Allí trabajé con siRNA para silenciar dos genes que se encuentran en el metabolismo de ácidos grasos. La experiencia fue una de mucho enriquecimiento. Bueno, ahora hablando de mi investigación en Puerto Rico durante este semestre planeamos hacer un PCR con el “primer upstream” nuevo para clonar a GFP. También, vamos a analizar la proteína mutante de GFP que obtuvimos durante el semestre pasado. Y por ultimo utilizar un vector nuevo para ver la expresión de los clones mutantes de GFP. El trabajo de este semestre es la secuencia de la investigación del semestre pasado. La técnicas de este semestre mayormente van a ser las mismas al semestre pasado, a excepción de la purificación y el análisis de la proteína.

Durante el semestre he aprendido varias tecnicas de genetica molecular y bioinformatica. He purificado plasmidio y transformado bacterias. Tambien, verificamos la secuencia de DNA de GFP usando varias herramientas de bioinformatica. El reto mayor ha sido el tiempo y la barrera fue el que no hubiesen salido las ordenes a tiempo de los materiales que pedimos  para agilizar la investigacion. Para superar la barrera tratamos de buscar otras vertientes para de esta manera no afectar la investigacion ya que un semestre es poco tiempo. Para el proximo semestre espero que tengamos todos los materiales para terminar la investigacion.

Durante este tiempo en mi laboratorio he aprendido varias tecnicas como lo es el preparar ampicilina, Caldo LB y placas LB/AMP, y hacer midi-preps de purificacion de plasmidio. La ampicilina se utiliza mayormente para crear medios selectivos, esto nos permite tener solmente las bacterias que tienen el plasmidio que le insertamos. Así, no tenemos contaminacion alguna en nuestros experimentos. La ampicilina se le añade al caldo LB y al LB con agar para hacer placas. El caldo LB y las placas LB/AMP se utilizan para sembrar y cultivar las bacterias. Y por ultimo, el midi-prep de purificacion de plasmdio lo utilizamos para verificar por medio de geles de electroforesis el tamaño de nuestro plasmidio y de esta manera asegurar que insertamos el plasmidio correcto. Ademas, utilizamos esta tecnica para enviar a secuenciar nuestro inserto en el vector de clonaje pGEM T-Easy. Con respecto a los blogs, es bueno interactuar con los compañeros, porque asi vamos conociendo mas acerca de lo que hacen en sus laboratorios y no nos quedamos aislados en el planeta BIO-Minds.

En la foto abajo están cuatro variantes de GFP que generamos utilizando el método de PCR. Las dos de arriba son en condiciones normal de PCR y la de abajo en la izquierda es la ronda #1 de PCR mutagénico y la de la derecha es la ronda #2 de PCR mutagénico ( La ronda #2 se obtuvo mutando nuevamente parte del producto de la ronda #1).